Kits pour la microscopie à Fluorescence...
 
 

Le test le plus efficace pour le diagnostic de la tuberculose !

Une technologie recommandée par l’OMS

Une très grande sensibilité grâce à la technique de concentration

Plus de problèmes de focalisation. Le kit est fourni avec des lames pré quadrillées.

 

COMMENT ÇA MARCHE ?

La tuberculose est diagnostiquée par l’observation des bactéries Mycobacterium tuberculosis dans un échantillon clinique prélevé chez le patient. Alors que d'autres enquêtes peuvent fortement suggérer la tuberculose, ils ne peuvent pas le confirmer. Comme de la cire, la membrane des bacilles de la tuberculose a une grande quantité d'acide mucolytique. Cet acide mucolytique a tendance à retenir un colorant primaire comme l’auramine orange même après exposition à une solution décolorante composée d’alcool et d’acide (d’où le terme bacilles acido-alcoolo-résistants « BAAR »). Les bactéries colorées sont ensuite observées en utilisant un microscope fluorescent pour confirmer le résultat positif de la tuberculose.

TECHNOLOGIE : LE PRINCIPE DE LA MICROSCOPIE A FLUORESCENCE

L'identification des mycobactéries avec auramine orange (de colorant fluorescent) est due à l'affinité de l'acide mucolytique dans la paroi cellulaire pour le fluorochrome. Par conséquent, Fluor-AFB est un procédé technique de microscopie à fluorescence basé sur des rayons lumineux de courte longueur d'onde qui éclairent un frottis coloré avec un fluorochrome tel que l’auramine orange. L’auramine orange a la propriété d'absorber des rayons lumineux de courte longueur d'onde et d’émettre des rayons lumineux de longueur d'onde plus longue.

Une lampe à vapeur de mercure ou une LED de dernière génération est utilisée comme source de lumière. Que ce soit avec une LED de longueur d'onde prédéfinie ou d’un filtre adapté, seuls les rayons lumineux d’une longueur d'onde plus courte peuvent être émis. Ces rayons sont adéquats pour la microscopie à fluorescence.
 

CARACTÉRISTIQUES et AVANTAGES

  Recommandé par l'MS 

Fluor AFB est l’unique kit à deux étapes pour le diagnostic de la tuberculose. De nombreuses études ont prouvé que la microscopie à fluorescence pour le diagnostic de la tuberculose est beaucoup plus sensible que la méthode de Ziehl-Neelsen classique qui est réalisée avec un microscope optique. Recommandation de l'OMS pour la procédure est certainement un joint d'authentification. 

  Dépistage à grande vitesse en raison d'un faible grossissement 
 L’examen des lames à un grossissement inférieur (60X) est l'avantage le plus important de la microscopie à épi-fluorescence. Elle permet ainsi d’examiner une surface beaucoup plus grande par unité de temps. Un champ examiné pendant 10 minutes à l’aide d’un microscope optique peut l’être en seulement 2 minutes avec un microscope à fluorescence.

  Le procédé de concentration unique augmente la sensibilité 
La présence des bacilles acido-alcoolo-résistants dans les crachats est le diagnostic le plus concluant de la tuberculose. Cependant,  à plusieurs reprises,  il y a un risque de passer à côté de leur détection en raison d’un nombre très faible de bacilles présents dans les crachats. Le procédé de prétraitement propre à Fluor-AFB permet de concentrer les bacilles de la tuberculose dans un prélèvement, et par conséquent d’augmenter considérablement la sensibilité. 

  Clairs et lumineux 

Le réactif mucolytique fourni avec le kit Fluor-AFB libère les bacilles de la tuberculose de mucus. La solution tampon maintient l'équilibre du pH nécessaire requis pour obtenir la luminosité optimale et une reproduction des couleurs. 

  Absolument sûr à utiliser 
 Il n’y a aucun risque de contamination lors de la centrifugation. Le kit Fluor-AFB est fourni avec un réactif de décontamination. Son composant actif est l'hypochlorite de sodium qui inactive les mycobactéries et permet d’obtenir une préparation décontaminée pour l'observation.

  Lames pré quadrillées pour une lecture rapide 
De nombreuses études ont prouvé que le diagnostic de la tuberculose par la microscopie à fluorescence est de loin plus sensible que la méthode de Ziehl-Neelsen classique réalisée avec un microscope optique. Cependant, la microscopie à fluorescence ne pouvait pas gagner en popularité à cause d'une faiblesse très importante. En effet, en l'absence de bacilles lumineux, le champ microscopique apparaissait sombre, ne donnant aucune possibilité de concentrer le frottis. Cela créait une confusion dans l'observation. Car un champ sombre pouvait être attribué à un échantillon négatif ou un frottis incorrectement éclairé. Le kit Fluor-AFB est fourni avec des lames spéciales quadrillées. Sur ces lames, des petites grilles carrées sont imprimées avec une encre spécialement formulée qui brille lorsqu’elle est exposée à la lumière ultraviolette bleue. Cela permet à l'utilisateur de concentrer son frottis. Avec le kit Fluor-AFB, il est maintenant possible de concentrer le frottis en quelques secondes, ce qui rend la détection facile et rapide.

APPRENTISSAGE

Le kit Fluor-AFB contient les réactifs suivants pour la réalisation de 100 colorations :

Réactif (A) : Solution de décontamination (1 x 200 ml)
Réactif (B) : Mucolytique (1 x 2,5 g)
Réactif (C) : Tampon (2 x 200 ml)
Réactif (1) : Fluorochrome (1 x 200 ml)
Réactif (2) : Solution décolorante (1 x 200 ml)
Réactif (3) : Solution contrastante (1 x 200 ml)

Lames quadrillées Fluor-AFB                                                    2x 50 lames

Nature des prélèvements
 
Crachats, liquide pleural, urine, nodule lymphatique, liquide de lavage broncho- alvéolaire.
      
Equipements complémentaires

Microscope à fluorescence avec un jeu d’objectifs x20, x40, x60
Association de filtres recommandés :
Filtre d’excitation : 485-570nm
Miroir dichromatique : 525-635nm
Filtre de suppression : 505-600nm

PRINCIPE DE LA COLORATION

La nature acido-résistante des mycobactéries est due au fait qu'un revêtement semblable à de la cire (acide mycolique) dans la membrane de ces micro-organismes empêche la libération du colorant par un traitement acide, une fois qu'il a été absorbé. Le kit Fluor-AFB est un procédé de coloration fluorescente de Mycobacterium tuberculosis en deux étapes.

1ère étape : pré - traitement des prélèvements  
                                                           
Afin de débarrasser les mycobactéries du mucus, il est recommandé de traiter les crachats avant la coloration. L’ingrédient actif dissout le matériel organique par oxydation laissant les BAAR intacts. Le pré - traitement de l’échantillon permet la décontamination, la libération des bacilles par une action mucolytique, la concentration, l’équilibre du pH pour une plus grande sensibilité de détection. Les échantillons histologiques doivent être traités pour enlever la paraffine, puis réhydratés. 

- Pré- traitement des crachats

Prendre des tubes à centrifuger propres et stériles (15-20ml) avec bouchons.                                                                                                                  

  1. Prendre 2ml de réactif A et ajouter une pincée (10mg) de réactif B, mélanger afin de dissoudre.
  2. Ajouter 2ml de crachats dans le tube à centrifuger et fermer. Bien mélanger à l’aide d’un agitateur Vortex pendant 10min.
  3. Dévisser soigneusement le bouchon du tube, puis ajouter 4ml du réactif C, et bien mélanger.
  4. Centrifuger à 4000rpm pendant 10min.
  5. Après centrifugation, dévisser soigneusement le bouchon et jeter le surnageant délicatement dans une solution de glutaraldéhyde 2%, sans troubler le culot.
  6. Ajouter 1ml d'eau distillée dans le tube et re-suspendre le culot.
  7. Utiliser cette suspension pour la préparation du frottis, la culture ou le PCR.

- Fixation des frottis (sur lames spéciales quadrillées)

La fixation du frottis sur des lames spéciales quadrillées est effectuée au dessus de la flamme d'un bec Bunsen ou d'une lampe à pétrole, par 2 ou 3 passages, en évitant un excès de chauffage.

2ème étape : procédure de coloration manuelle

Remplir les bacs  de coloration avec 50ml de réactifs 1, 2, 3. Remplacer après 50 colorations environ. Pré - chauffer la solution 2 et 4 à 40-50°C  approximativement au bain-marie.  Chronométrer les différentes étapes de la coloration.

Colorants                                                                          Temps (min)

Réactif 1 (solution de coloration)                                         15
Rinçage avec de l'eau du robinet
Réactif 2 (décoloration)                                                          3
Rinçage avec de l'eau du robinet
Réactif 3 (contre- coloration)                                                 5
Rinçage avec de l'eau du robinet
Sécher les frottis à l’air.

Sécher les frottis à l’air. Les coupes histologiques doivent être traitées avec des concentrations croissantes d'alcool et de xylène avant le montage avec le DPX.

Résultat de la coloration, morphologie et diagnostic des BAAR

Les lames peuvent être examinées en utilisant de l'huile à immersion claire ou  montées avec du DPX.

Les bacilles acido-alcoolo-résistants colorés en jaune or sont clairement distingués sur un fond noir. La morphologie typique des BAAR est mince et légèrement incurvée. Les bâtonnets granulaires acido-alcoolo-résistants sont partiellement visibles ainsi que les cordes typiques formant des colonies.

Le diagnostic est rapporté en terme de « bacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) détectés ou non détectés ».
 
L'infection à Mycobacterium tuberculosis  doit être considérée pour n'importe quel patient présentant des frottis BAAR positifs et répétitifs indépendamment du nombre de bacilles observés.

TRANSCRIPTION DES RESULTATS SELON L'ETABLISSEMENT INDIEN DE REFERENCE, APRES EXAMEN DE 100 CHAMPS MICROSCOPIQUES PENDANT 5 MIN.

  Aucun BAAR                       Négatif
  1-10 BAAR                                         Nombre réel de BAAR
  >10 BAAR                                     +
  Amas de BAAR dans plusieurs champs           ++

La confirmation du diagnostic de la tuberculose nécessite des techniques complémentaires telles que la culture, la PCR ou d’autres tests recommandés.

Note : Les lames quadrillées contenues dans le kit sont fabriquées en utilisant de l’encre blanche hydrophobe spécialement formulée qui émet une fluorescence vert-mate à partir d’une source lumineuse bleue. Il est recommandé d'employer seulement ces lames car elles aident l'utilisateur à focaliser convenablement et rapidement le champ microscopique du frottis sur un fond noir
 
 
 

FAQ (FOIRE AUX QUESTIONS)

Peut-on utiliser d’autres types de prélèvements que les crachats avec le kit Fluor-AFB ?
Oui, des prélèvements tels que le liquide céphalorachidien, les lavages broncho- alvéolaires peuvent être utilisés.
 
Peut-on acheter séparément des lames pré-quadrillées focus it fast ?
Bien sûr ! Veuillez contacter votre revendeur Florotek autorisé.
 
Peut-on acheter séparément des composants du kit Fluor - AFB ?
Bien sûr ! Veuillez contacter votre revendeur Florotek Biosystems autorisé.
 
Une fois colorée combien de temps faut-il attendre avant d'observer une lame ?
Il est recommandé d'observer la lame immédiatement après coloration. Cependant, il a été observé que la coloration est stable pendant jusqu'à 12 heures.
 

LITERATURE

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